Clonage De Genes Codant Pour De Nouvelles ADN Poymerases ADN-Dependantes De Thermococcales. Mise En Evidence De Nouvelles Inteines

Marie-Anne CAMBON, Joël QUERELLOU
IFREMER, Laboratoire de Biotechnologie des Micro-organismes Hydrothermaux, BP 70, 29280 Plouzané
Les ADN polymérases ADN dépendantes sont classées en quatre classes (A, B, C et X) selon leur séquences. Les quatre gènes d'ADN polymérases des Thermococcales décrits à ce jour font partie de la classe B. Ils présentent deux domaines, l'amont codant pour la partie exonucléase 3'-5' et l'aval pour la polymérase. Certains de ces gènes ont la particularité d'être morcelés non par des introns classiques mais par des intéines, introns épissés au stade post- traductionnel. Dix nouveaux isolats obtenus de l'IFREMER de Brest et du CNRS de Roscoff ont été retenus pour réaliser le clonage et le séquençage des gènes d'ADN polymérases. La stratégie de clonage est basée sur la possibilité d'utiliser les séquences publiées des gènes de Thermococcus litoralis et de Pyrococcus furiosus. Des sondes hétérologues ont été synthétisées par PCR et marquées au 32P afin de repérer des fragments d'intérêt à cloner dans divers vecteurs (pUC, pBlueScript, pET). Les sondes Pfu ont permis de cloner la partie proximale des gènes de Thermococcus sp. GE8 et Pyrococcus sp. GE23. Les diverses tentatives de clonage des gènes complets se sont révélés infructueuses quels que soient les plasmides utilisés ou les souches hôtes (DH5a, SURE, XllBlue, NovaBlue), les constructions étant systématiquement instables. Les gènes complets ont finalement été obtenus par PCR-LD et séquencés. Le gène de Pyrococcus abyssi a été amplifié par PCR avec les amorces de l'isolat GE23, et totalement séquencé. Le gène de l'isolat GE23 a servi de sonde pour le repérage de fragments d'intérêt du gène de l'isolat T. sp. ST557, et son clonage en trois fragments aujourd'hui totalement séquencé. Les résultats actuels sont les suivants : - P. sp. GE23 et P. abyssi ont des gènes dépourvus d'intéines à l'instar de P. furiosus. - T. sp. GE8 a un gène morcelé avec deux intéines de mêmes types que celles de T. litoralis, insérées aux mêmes sites B et C. - T. Sp. ST557 possède une structure de gène hybride non encore décrite avec l'intéine de type P. sp. KOD1 dans le motif A et l'intéine de type Tli-J dans le motif C du gène (nomenclature F. Perler). L'alignement des quatre gènes obtenus et des quatre gènes disponibles dans les banques a mis en évidence de courtes régions conservées typiques des gènes dna pol de Thermococcales. Ces régions ont été sélectionnées pour la construction d'amorces dégénérées, utilisées ensuite pour cribler les autres isolats.