Structure Et Expression De L'aspartate Transcarbamylase De Pyrococcus Abyssi

Cristina PURCAREA1,2, Guy HERVE2 et Raymond CUNIN1
1 Erfelijkheidsleer en Microbiologie, Vrije Universiteit Brussel, Bruxelles, Belgique
2 URA CNRS 1682, Université Pierre et Marie Curie, Paris, France
L'aspartate transcarbamylase (ATCase) catalyse la première étape de la biosynthèse de novo des nucléotides pyrimidiques. L'activité de l'ATCase d'Escherichia coli, la mieux caractérisée de cette famille d'enzymes, est hautement régulée par la fixation de nucléotides triphosphates sur des sous-unités régulatrices spécialisées et constitue un modèle pour l'étude des interactions allostériques. Un des substrats de la réaction, le carbamylphosphate, est très thermolabile et sa dégradation produit du cyanate, qui est hautement toxique pour la cellule. Le métabolisme du carbamylphosphate à températures élevées et, en particulier, les stratégies mises en oeuvre pour sa protection contre la dégradation, ainsi que les mécanismes de transmission intramoléculaire des signaux régulateurs sont des thèmes majeurs de recherche de nos deux laboratoires. Pyrococcus abyssi a été caractérisée comme une archaebactérie hyperthermophile anaérobie, soufre-dépendante et barophile-barotolérante. La souche GE5 a été isolée d'une source volcanique hydrothermale située à 2000 m de profondeur dans le bassin des îles Fidji. La température de croissance de P. abyssi est comprise entre 67*C et 102*C avec un optimum de 96*C, à la pression atmosphérique. Dans les extraits dialysés de P. abyssi, l'activité ATCase est extrêmement thermostable et soumise à une régulation allostérique par plusieurs nucléotides. Le gène qui code pour l'ATCase de P. abyssi a été cloné par complémentation dans une souche JM103 pyrB-de E. coli en utilisant la banque génomique construite dans un vecteur dérivé du phage lambda (Lambda ZAP Express). La séquence nucléotidique présente le meilleur score d'homologie avec le gène qui code pour la protéine CAD de Squalus acanthias. En ce qui concerne la structure primaire, l'ATCase de P. abyssi semble être plus proche des enzymes homologues des enterobactériaceae. Les changements de certains acides aminés conservés dans les chaînes catalytique et régulatrice des ATCases (accroissement du nombre de résidus chargés et réduction du nombre de résidus instables à hautes températures, comme Gln, Asn et Trp) pourraient être liés à la thermostabilité de cette enzyme archaebactérienne. La réponse aux dérivés nucléotidiques est liée à la présence des sous-unités régulatrices, très conservées par rapport à celles présentes chez les Enterobactériaceae. Ceci est le premier cas identifié d'une telle organisation chez les transcarbamylases d'Archaea. Toutefois, l'amplitude de la régulation est réduite lors de l'expression dans une souche transgénique d'E. coli. La remarquable thermostabilité de l'ATCase de P. abyssi (100% de conservation d'activité après 6 heures d'incubation à 90*C) est également réduite (60%) dans le cas de son expression dans un hôte eubactérien mésophile. Ces altérations résultent probablement de modifications dans le répliement de cette enzyme et de l'absence d'association stabilisatrice avec une ou plusieurs autres protéines lors de l'expression hétérologue chez E. coli.