Recombinaison Chez Les Hyperthermophiles: L'integrase Du Virus SSV1 De Sulfolobus Shibatae

Marie-Claude SERRE1 et Georgi MUSKHELISHVILI2
1: Laboratoire d'Enzymologie et Biochimie Structurales, Bat.34, Avenue de la Terrasse 91198 Gif-sur-Yvette
2: Institut fur Genetik u. Mikrobiologie, Maria-Ward-Strasse 1a, 80638 Munchen.
La recombinaison spécifique de site est un mode de plasticité génétique qui se retrouve dans de nombreux organismes procaryotes et eucaryotes. L'existence de tels évènements chez les Sulfolobales a été postulée et récemment mise en évidence par le groupe de W. Zillig. Sulfolobus shibatae  B12 est sensible au virus SSV1. Dans la cellule, le génome viral existe sous deux états : une forme épigénique et une forme intégrée de manière spécifique dans le chromosome de l'hôte. L'intégration de SSV1 dans le chromosome de Sulfolobus shibatae  peut être décrite comme celle du phage lambda dans le chromosome d'Escherichia coli : deux sites spécifiques, l'un situé sur le chromosome de l'hôte, attB, et l'autre sur le génome viral, attP, sont reconnus par une protéine virale, l'intégrase, éventuellement assistée de protéines de l'hôte. Après synapse des deux sites, la coupure et l'échange de brins entre les deux ADN partenaires interviennent à une position précise et conduisent à la forme virale intégrée flanquée de deux sites recombinants, attL et attR. L'excision du phage intervient selon le même type de mécanisme, mais pourrait nécessiter une autre protéine virale, l'excisionase. Notre projet concerne l'étude de l'intégrase virale et du mécanisme d'intégration qu'elle catalyse. L'étude enzymatique et structurale de l'intégrase nécessite de grandes quantités de protéine. Nous avons donc cloné le gène de l'intégrase sous contrôle d'un promoteur inductible à l'arabinose, et surproduit la protéine chez E. coli . La purification de l'enzyme est en cours, et nous comptons pouvoir répondre prochainement aux questions suivantes: Bien que l'on puisse reproduire in vitro des évènements de recombinaison, la réaction n'est pas stringente (i.e. deux sites attB peuvent recombiner entre eux par exemple). Y-a-t-il des facteurs de l'hôte "guidant" la réaction d'intégration ? Quels sont les déterminants de la reconnaissance des sites att, et quelle est la liaison phosphodiester coupée ? La réaction de recombinaison fait-elle intervenir un intermédiaire réactionnel covalent ? Par ailleurs, l'obtention de grandes quantités de protéines nous permettra de démarrer une étude structurale, et d'accéder ainsi à l'organisation tridimentionnelle de l'intégrase.