GDR Bactocean
Programme de Recherche
Adaptation physiologique et moléculaire aux conditions extrêmes
2. Adaptation physiologique et moléculaire aux conditions extrêmes
2.1 Objectifs:
Etudier, au travers de souches modèles, le comportement des microorganismes entiers ou de certaines de leurs molécules constitutives (enzymes, polymères, ADN) en fonction des paramètres majeurs (température, pression, ressources trophiques, composés toxiques) de l'environnement hydrothermal et de leurs fluctuations.
2.2.1. Etude des ADN polymérases:
Ce travail est effectué par le GRA (P. Forterre, A. Bouyoub) en collaboration avec le LBMH (J. Querellou). Les étapes suivantes sont prévues:
Identification et caractérisation préliminaire des activités ADN polymérases dans des extraits bruts préparés à partir des souches hyperthermophiles de la collection (thermostabilité, sensibilité à l'aphidocoline, poids moléculaire).
Clonage d'un ou plusieurs gènes codant pour ces ADN polymérases. Utilisation de ces gènes pour la caractérisation des souches de la collection (PCR fingerprinting). Comparaison aux données obtenues avec les ARN ribosomaux. Expression chez E.coli d'une ou plusieurs ADN polymérases, évaluation de leurs capacités pour l'amplification de gènes par la méthode PCR, comparaison avec les ADN polymérases actuellement sur le marché.
Recherche de protéines introns et d'endonucléases thermostables site-spécifiques pouvant être utilisées pour la cartographie génétique.
2.2.2. Les osidases thermostables:
Le LBMH (A. Godfroy, C. Ladrat) a effectué l'étude approfondie d'une souche thermophile (ST549) ß-galactosidase et ß-glucosidase positive et de la protéine thermostable correspondante. Le clonage puis le séquençage du gène correspondant sont à effectuer ainsi que des travaux complémentaires sur les caractéristiques de la protéine susceptibles d'expliquer sa thermostabilité. Le potentiel de cette enzyme en technologie enzymatique doit être étudié en liaison avec le LTE.
Le LTE travaille sur 3 enzymes thermostables à activité ß-galactosidase présentant une activité ß-glucosidase: l'une isolée, purifiée et caractérisée à partir de Sulfolobus solfataricus, la seconde provient de Caldocellum saccharolyticum recombinée chez E. coli et la troisième provient de l'isolat ST549 mentionné ci-dessus.
Dans le cadre de sa thèse, V. Hamon utilise ces osidases pour déterminer et comparer les paramètres cinétiques tels que: température optimales de fonctionnement, optima de pH, constantes cinétiques. A titre de comparaison, les mêmes types d'expériences sont faits avec une enzyme classique extraite d'amande. Deux études fondamentales sont réalisées afin de déterminer s'il existe un seul site catalytique commun ou deux sites séparés pour les deux activités ß-glucosidase et ß-galactosidase.
Le LTE vient de se doter d'un réacteur pouvant fonctionner sous pression et à température élevée (4000 bars, 120*C). Des tests comparatifs d'activités classiques d'hydrolyse pourront donc maintenant être réalisés avec les différents types d'enzyme: thermostables issues des environnements enzymatiques profonds, thermostables terrestres et enzymes de mésophiles. L'effet de la pression sur les cinétiques d'hydrolyse, la réversibilité ou non des effets, les modifications des spécificité de réactions seront étudiées.
Ce travail sera poursuivi par une thèse à débuter en septembre 93, sur le projet suivant: Les réactions non conventionnelles de synthèse et de transfert catalysées par les mêmes osidases seront testées en conditions normales de température et de pression, puis en faisant varier l'un puis les deux paramètres. Les réactions envisagées devraient permettre l'obtention d'oligosaccharides, d'aryl et d'alkylglycosides, d'amino-sucres et de sucro-esters d'intérêt industriel (agro-alimentaire, pharmacologie, chimie fine).
2.2.3. Les alcools déshydrogénases:
Le LBMH (A. Godfroy, C. Ladrat) a effectué l'étude d'une souche thermophile (AL662) alcool déshydrogénase positive et de la protéine thermostable correspondante. La caractérisation de l'enzyme reste à poursuivre. Le potentiel de cette enzyme en technologie enzymatique doit être étudié en liaison avec le LTE.
Les alcools déshydrogénases classiques et thermostables sont utilisées en faisant varier les paramètres de température et de pression séparément puis ensemble (thèse de S. Dallet au LTE). Les ADH thermostables proviennent de Sulfolobus solfataricus et de l'isolat AL662 du LBMH. Les alcool déshydrogénases sont des enzymes à cofacteurs. Il est vraisemblable que la pression va modifier la diffusion du cofacteur (sous forme oxydée et réduite) et l'enzyme. Là encore, les expériences seront réalisées avec une enzyme des environnements océaniques profonds, une enzyme issue des environnements volcaniques et une enzyme de mésophile .
2.2.4. Activités estérases et lipase:
Le LBMH a engagé la recherche de souches thermophiles présentant des activités estérase (thèse de L. CORNEC). Environ quarante de souches ont montré une telle activité. L'isolat ST549 présente une activité très thermostable. Ce travail est dirigé vers la recherche de lipases thermostables qui font totalement défaut actuellement, cette activité étant inconnue chez les archaebactéries thermophiles jusqu'à présent. Si une activité lipase était mise en évidence, le travail serait focalisé sur l'étude de cette enzyme. A défaut, les activités estérase repérées seront étudiées du point de vue de leur spécificité afin de retenir le ou les modèles d'étude prioritaires selon la séquence de travail suivante: clonage et séquençage, purification puis caractérisation de l'enzyme, mise en oeuvre en technologie enzymatique (synthèse d'esters).
2.2.5. Etude de l'aspartate transcarbamylase d'une Archaea sulfothermophile:
Ce travail est exclusivement mené par le laboratoire d'Enzymologie (LE) dirigé par G. Hervé.
L'une des difficultés auxquelles sont soumises les Archaea hyperthermophiles est la grande instabilité de certains métabolites. C'est le cas en particulier du carbamylphosphate nécessaire à la synthèse des nucléotides pyrimidiques d'une part, de l'arginine d'autre part. Ce métabolite est synthétisé par la carbamylphosphate synthétase (CPSase). Il est utilisée comme substrat par l'aspartate transcarbamylase (ATCase) dans la voie de biosynthèse des nucléotides pyrimidiques, et par l'ornithine transcarbamylase (OTCase) dans la voie de biosynthèse de l'arginine.
De plus, sur la base de connaissance détaillée du mécanisme de la coopérativité et de la régulation allostérique de l'ATCase d'E. coli, il est intéressant d'examiner la structure et les propriétés de l'ATCase des Archaea hyperthermophiles, afin d'obtenir des informations au niveau moléculaire, sur l'adaptation de cette Archaea aux conditions extrêmes de température et de pression.
Le travail a commencé sur la souche GE5 (isolée par le LBM), prise comme souche modèle. Il consiste à déterminer les propriétés catalytiques et régulatrices de GE5; purifier l'ATCase; étudier l'influence de la pression et de la température sur ces propriétés. L'étude des propriétés cinétiques de la CPSase et de l'origine du groupement aminé (NH4+ ou glutamine) est en cours. Enfin, la recherche par les méthodes cinétiques d'un éventuel phénomène de canalisation direct du carbamylphosphate de la CPSase à l'ATCase a débuté. Deux autres étapes sont projetées: étude des propriétés cinétiques de l'OTCase et recherche d'une éventuelle canalisation du carbamylphosphate dans cette voie métabolique; essais de cristallisation de l'ATCase, en vue d'études structurales.
L'une des caractéristiques des fluides hydrothermaux est leur forte teneur en métaux lourds, d'où l'intérêt de l'étude de la résistance aux métaux des microorganismes, et des mécanismes génétiques impliqués.
Ce travail a été initié au LBM par C. Jeanthon dans le cadre de sa thèse et se poursuit actuellement. Les premiers travaux ont porté sur des Eubactéries mésophiles, pour lesquelles les CMI de plusieurs métaux (cadmium, zinc, cuivre, argent, arsenic) ont été déterminées. Une seconde étape a consisté en un crible pour la détection de plasmides. De 1 à 5 plasmides ont effectivement été détectés dans 20% des souches étudiées. Des plasmides de tailles identiques, possédant des homologies, ont été mis en évidence chez des phénotypes différents, ce qui tend à indiquer l'existence de transferts génétiques dans l'écosystème. Certains de ces plasmides semblent être impliqués dans la résistance à l'arsénite et l'arséniate. De plus certains autres plasmides possèdent des homologies avec le transposon Tn4380, porteur du gène merA impliqué dans la résistance au mercure.
Ce travail sera poursuivi en incluant d'autres groupes de microorganismes et en particulier les Eubactéries sulfo-oxydantes, et les Archaea sulfothermophiles. Les souches disponibles au LBM et au LBMH (Thiobacillus hydrothermalis, GE5, souches du bassin de Lau) seront utilisées pour des expériences préliminaires de détermination de CMI. Cette étape est indispensable pour définir les concentrations en métaux nécessaires à la sélection ultérieure par enrichissement, de micro-organismes adaptés. Par la suite, le choix des métaux étudiés sera guidé par le dosage dans chaque échantillon hydrothermal analysé des éléments les plus abondants. Après purification des bactéries résistantes, leurs CMI seront mesurées.
La recherche des gènes impliqués dans la résistance aux métaux sera ensuite entreprise. Les gènes de résistance, une fois clonés, pourront être utilisés sous forme de sondes nucléiques, pour mesurer tant qualitativement que quantitativement leur distribution dans l'écosystème hydrothermal. La découverte de souches d'Archaea sensibles et de leurs mutants résistants sera également d'une grande utilité pour la réalisation du projet vecteur de clonage (voir 3.4). Un DEA, puis une thèse seront initiés dès que possible sur ce sujet.
Cette thématique a été abordée dès 1988 dans le cadre du travail de thèse de P. Vincent au LBM, relayé par des travaux de chimie et physico-chimie au LBMH (P. Pignet), LCB et CERMAV. P. Vincent a pu sélectionner 17 souches bactériennes, appartenant très vraisemblablement au genre Alteromonas, et à une même espèce, mais que l'on peut différencier en 4 groupes. A chacun de ces groupes établis sur la base de critères microbiologiques, correspondent 4 familles de polysaccharides. Ces polymères se sont révélés suffisamment originaux pour qu'un brevet soit pris par Ifremer en février 1993.
Actuellement, le LBM a cessé les activités de crible dans ce domaine, et n'envisage pas de les reprendre de manière systématique. Le LBMH (G. Raguenes) a poursuivi la recherche de souches productrices à partir d'échantillons d'autres sites hydrothermaux. Selon l'originalité des polymères obtenus au plan chimique (J. Guézennec, P. Pignet) et/ou rhéologique (CERMAV), l'étude approfondie de souches productrices et des polymères sera envisagée.
La souche 1644 sélectionnée et étudiée par P. Vincent est actuellement cultivée au CERMAV en fermenteur, et ses produits analysés. Il sera donc possible de suivre l'évolution de l'excrétion en cours de fermentation, d'améliorer la production d'exopolymère et d'analyser la production éventuelle d'hydrolase dans le milieu de culture. Cette souche étant, au minimum barotolérante, le CERMAV envisage avec le LBMH de lui faire produire des polysaccharides en reproduisant ces conditions afin de mettre en évidence éventuellement l'influence de la pression sur la nature et les propriétés des polysaccharides sécrétés.
L'étude des propriétés du polymère 1644 est actuellement en cours afin de caractériser les relations entre la structure et les propriétés du polysaccharide. Quatre points essentiels seront abordés ou poursuivis.
a) Etude des conformations: rôle des substituants, des conditions de milieu et de la structure chimique. Cette étude portera d'après les connaissances actuelles sur le polysaccharide 1644. Il sera important de préciser le rôle exact de cette structure ordonnée sur la formation d'associations intermoléculaires et en particulier sur la gélification. La nature de cette transition conformationnelle sera recherchée.
b) Les dimensions moléculaires ([h],Rg) en relation avec les interactions électrostatiques. Le polysaccharide 1644 a une densité de charge élevée. Cela devrait permettre d'approfondir le rôle des forces électrostatiques sur les propriétés des molécules isolées et de confronter les résultats obtenus aux théories récentes prenant en compte ces interactions électrostatiques. Cette étude ne pourra être réalisée que si l'on peut obtenir des solutions de 1644 moléculairement dispersées. Une recherche sera effectuée dans ce sens.
c) Les propriétés rhéologiques. Ces études permettront d'apporter une contribution à la rhéologie des solutions de polymères semi-rigides ainsi que de tester les applications industrielles potentielles de ces polysaccharides. De plus, ces études appliquées au 1644 seront très importantes pour essayer de comprendre les originalités de ce polysaccharide. Dans ce but, sur ce polysaccharide, le mécanisme de gélification et la nature des noeuds de réticulation en relation avec la valence des ions, la présence des substituants acétate ainsi que l'influence de ces paramètres sur les propriétés mécaniques des gels formés seront étudiés. L'étude du pouvoir de suspension des solutions de 1644 sera effectuée en relation avec les conditions de milieu (concentrations en ions, en polymère, nature des ions compensateurs).
d) Interaction avec les ions. L'étude de la conformation du 1644 en solution, ainsi que du mécanisme d'association intermoléculaire qui conduit suivant les concentrations ioniques soit à une solution très visqueuse (pouvoir épaississant ou de stabilisation de suspensions élevé) soit à la formation d'un gel très élastique, nécessite des interactions des ions compensateurs (calcium) avec le polysaccharide. Cette étude sera effectuée par conductimétrie et par potentiométrie à l'aide d'électrodes spécifiques. Pour accompagner et poursuivre le travail de thèse de L. Bozzi, un DEA pourrait être recruté en octobre 1993.
Enfin, un des projets ambitieux du CERMAV est l'étude des mécanismes de biosynthèse des polysaccharides; ce nouveau thème devrait être introduit très prochainement au laboratoire. Une participation de ce groupe au GDR est envisagée puisque les bactéries semblent être de bons candidats pour ce type d'étude. Il s'agit d'une opération à long terme qui ne fera que démarrer dans ce cadre. Cependant, la présélection d'un système déjà bien étudié par les participants de ce groupe, lui donne de grandes chances d'avancer.
2.5. Réponse des micro-organismes aux fluctuations de l'environnement:
2.5.1. Réponse à la pression hydrostatique:
Les Archaea hyperthermophiles, qu'elles proviennent de sites terrestres, côtiers ou de sources hydrothermales profondes, sont cultivées au laboratoire sous une faible pression de gaz (2 atmosphères) destinée à éviter l'ébullition du milieu de culture aux températures voisines et supérieures à 1 00*C (actuellement, les limites supérieures connues pour la vie de ces microorganismes sont de 105-110*C).
En milieu océanique profond (2000 m et davantage) la pression hydrostatique permet à l'eau de demeurer liquide à des températures de l'ordre de 350*C. Les Archaea qui sont actuellement en collection viennent de ces profondeurs et ont été obtenues après cultures d'enrichissement sous faible pression de gaz. Par ailleurs, il convient de rappeler que le seuil au dessous duquel commence à apparaître des caractères barophiles chez les bactéries (cela a été montré chez les psychrophiles) est également de 2000 m.
Pourtant, selon divers essais, dont certains réalisés au LBM, certaines de ces Archaea, lorsqu'elles sont exposées à une pression de 200 à 400 atmosphères, montrent une augmentation de quelques degrés de leur température optimale, et de leur température maximale. De plus, des essais d'enrichissement sous pression hydrostatique (260 atmosphères) d'Eubactéries mésophiles venant de sources hydrothermales situées à 2600 m de profondeur ont conduit le LBM à isoler des souches présentant une croissance améliorée sous pression, et exprimant sous 260 atmosphères, davantage d'activités enzymatiques.
Compte tenu de ces résultats, les axes de recherche suivants sont prévus.
a) Procéder sur des échantillons d'origine hydrothermale venant de différentes profondeurs (2000-2600 mètres dans le Pacifique, 3500 mètres dans l'Atlantique) à des enrichissements en conditions "in situ" simulées de température et de pression, de manière à sélectionner les souches les plus baro-thermophiles possibles.
b) Décrire les phénotypes de ces souches sous pression hydrostatique
c) Rechercher l'existence d'un gène susceptible d'être régulé par la pression hydrostatique tel que le gène de l' omph mis en évidence chez une Eubactérie abyssale par Bartlett et al. (1989).
Les souches ainsi isolées seront confiées aux autres laboratoires pour les études enzymologiques (LBMH, LE, LTE) et moléculaires (GRA) appropriées. Selon les résultats obtenus par D. Prieur, V. Marteinsson et M. Vernet, un DEA et un travail de thèse pourraient être engagés.
2.5.2. Effet des conditions limites de température:
D'après les observations du LBM et du LBMH, il y a de fortes raisons de penser que les archaebactéries hyperthermophiles vivent dans les parois des cheminées hydrothermales actives, et sont localisées à un niveau leur permettant une activité optimale.
Cependant les fluctuations thermiques dues aux variations de l'activité hydrothermales peuvent modifier momentanément les conditions de leur environnement immédiat. Une diminution de la température, qui peut ralentir ou supprimer momentanément l'activité bactérienne, n'a pas de conséquence fatale. En effet, ces micro-organismes anaérobies stricts deviennent moins sensibles à l'oxygène, lorsque la température s'abaisse nettement au dessous de celle permettant la croissance. Cette propriété, dont le mécanisme n'est pas connu, permet aux cellules de survivre dans l'océan et de se disperser avant de coloniser un nouveau site. Par contre, une élévation trop importante de température peut conduire à la mort des cellules. Entre cette valeur létale inconnue, et la valeur au delà de laquelle la croissance n'est plus possible, existe un domaine d'amplitude inconnu, dans lequel les cellules peuvent survivre pendant une durée indéterminée.
Les souches actuellement en collection, sont originaires d'une profondeur de 2000 mètres, et donc supportaient "in situ" une pression voisine de 200 atmosphères. Il est donc nécessaire d'envisager une partie des expérimentations sous pression "in situ" simulée.
Cette thématique fera l'objet de la thèse de V. Marteinsson au LBM. La première année de recherche sur ce sujet consistera à soumettre une souche modèle, pour des périodes plus ou moins longues à des températures basses ou élevées, en pression atmosphérique ou en pression "in situ". La souche modèle utilisée est la souche GE5, isolée au LBM par G. Erauso, et désormais bien caractérisée.
Pour chaque série d'essais, les cellules seront dénombrées en épi fluorescence, sur milieu de culture, et cytométrie en flux. Cette dernière méthode permettra en outre de mesurer la taille des cellules et d'être informé sur sa teneur en ADN et son état physiologique. On procédera également à une électrophorèse des protéines totales et des protéines membranaires, de façon à rechercher des molécules éventuellement caractéristiques de conditions environnementales particulières.
Quel est l'intérêt de ce projet pour des applications biotechnologiques? Deux types d'informations sont susceptibles de valorisation. D'une part, la survie, à de fortes températures, même pour de courtes périodes, doit mettre en jeu des molécules thermorésistantes qu'il conviendrait d'identifier. D'autre part, les conditions de survie aux basses températures et en milieu aérobie, si elles peuvent être précisées, doivent permettre d'alléger les protocoles de manipulation de ces souches, et donc leur exploitation industrielle.
Les micro-organismes actuellement étudiés au LBM et LBMH sont cultivés dans des conditions nutritionnelles, sinon optimales, du moins favorables à la croissance, et stables. Or, dans le milieu originel, les ressources trophiques fluctuent très certainement. Se pose alors la question des mécanismes d'attente, de survie ou de dormance des micro-organismes concernés. Les techniques de conservation des échantillons régulièrement utilisées au LBM et LBMH, et notamment la conservation à 5*C en milieu réduit, montre à l'évidence que ces micro-organismes survivent à des conditions qui ne permettent plus la croissance. Le phénomène a été bien étudié chez quelques bactéries marines, par des équipes américaines et suédoises. Les résultats obtenus montrent d'ailleurs qu'il est difficile de séparer les effets de la pression, de la température et des concentrations en nutriment. L'étude de ces phénomènes, qui permettra d'expliquer les mécanismes de dispersion et de recolonisation des sites sera entreprise progressivement. Là encore, des sujets de DEA et thèse sont possibles, après que les principales pistes d'investigation aient été identifiées. L'ambition du LBM est d'initier ces travaux au cours des trois prochaines années.
2.6. Etude de la topologie de l'ADN des Archaea sulfothermophiles:
Suite à la découverte de la reverse gyrase, enzyme présente chez tous les Procaryotes thermophiles et qui introduit des supertours positifs dans l'ADN, se posait le problème du type de surenroulement de l'ADN chez ces microorganismes. Etait-il surenroulé négativement comme chez tous les organismes vivant, ou surenroulé positivement par la reverse gyrase? La découverte d'un plasmide (pGT5) dans la souche GE5 isolée au LBM a permis de répondre à cette question. F. Charbonnier et P. Forterre (GRA) ont montré que le plasmide pGT5 était relâché (absence de surenroulement) à la température de croissance de cette bactérie (95*C), ce qui n'avait jamais été observé sur un plasmide à l'état naturel.
Ce travail sera poursuivi au GRA, en collaboration avec le LBM par l'étude de l'effet du surenroulement sur la stabilité de l'ADN à haute température, ainsi que de l'effet de la température et de la pression sur la topologie de pGT5 (F. Charbonnier, E. Marguet). En collaboration avec M. Thomm (Ulm, Allemagne), l'effet du surenroulement sur la transcription du plasmide pGT5 sera étudié "in vitro " .
Révision le 10/12/96
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