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Programme de Recherche
Biotechnologie des micro-organismes hydrothermaux
3. Biotechnologie des micro-organismes hydrothermaux:
Cette thématique consiste à développer des méthodes et techniques utilisant les propriétés des micro-organismes hydrothermaux mises en évidence lors des étapes précédentes en vue de valorisations industrielles.
3.1. Optimisation des conditions de culture et de fermentation:
Dès lors que des souches sont étudiées parce qu'elles produisent une ou des molécules potentiellement valorisables, l'optimisation des conditions de culture en fermenteur à des fins de production s'avère nécessaire. Pour des souches telles que les mésophiles aérobies productrices de polysaccharides ce travail peut être conduit selon une approche classique. Pour ce qui concerne les souches hyperthermophiles soufre dépendantes, les équipements sont à développer (nécessité de disposer d'équipements résistants à la corrosion: salinité, sulfures et hautes températures) et les conditions de culture à définir pour la production de masse (milieu, agitation, dégazage,...). Ces travaux ont été engagés au LBMH qui a conçu et fait construire un premier fermenteur de 10l en acier pour la culture des souches hyperthermophiles. Compte tenu des contraintes d'équipement, la culture en continue sera probablement privilégiée par rapport à la culture en "batch".
Le LTE travaille sur deux types d'enzymes en réacteur solide-gaz. D'une part les cellules de 1'isolat AL662 fournies par le LBMH, et porteuses d'une activité ADH sont testées dans ce type de réacteur (DEA d'A. Buckenmeyer). L'enzyme est utilisée sous forme de poudre et représente la phase solide et les substrats et produits sont utilisés sous forme gazeuse à température élevée. L'activité ADH thermostable est étudiée en vue d'une part de comprendre le rôle de l'eau dans la catalyse dans ces milieux peu hydratés, et d'autre part de produire par voie biotechnologique des arômes de type aldéhyde avec le label "naturel". Le second type d'enzyme étudiée en réacteur solide-gaz est la cutinase thermostable de Fusarium solani, pour des réactions de transestérification (thèse de S. Lamare). Des expériences sont actuellement en cours afin de comprendre le mécanisme réactionnel de cette enzyme, et le rôle de l'eau sur son activité et sa stabilité. Cette cutinase est une estérase à activité lypolytique. Son activité est donc comparée à celle d'une lipase classique utilisée dans les mêmes conditions. Des essais avec une estérase ou des cellules présentant une activité estérasique venant d'un isolat hydrothermal sont prévus, dès que le matériel sera disponible au LBMH.
3.3. Piégeage des métaux par les polysaccharides:
Les micro-organismes, y compris les actinomycètes, cyanobactéries et autres bactéries ont la capacité d'accumuler des métaux lourds et radionucléides à partir de leur environnement. Les quantités accumulées peuvent être importantes et une variété de mécanismes peuvent être invoqués depuis les interactions physico-chimiques comme l'adsorption et le dépôt jusqu'aux processus du métabolisme cellulaire . Les cellules aussi bien vivantes que mortes sont capables de prélèvement et d'accumulation mais également les produits excrétés ou dérivés des cellules bactériennes comme les polysaccharides et les constituants des parois cellulaires. De tels processus sont d'un intérêt industriel pour la suppression des métaux lourds potentiellement toxiques .
Les exopolysaccharides bactériens d'origine hydrothermale peuvent, au regard de caractéristiques physico-chimiques (teneurs en oses acides et oses amines, substituants sulfates et pyruvates) constituer d'excellents bioaccumulateurs de métaux solubles et particulaires, spécialement pour de faibles concentrations et les technologies qui en dérivent peuvent fournir une alternative aux techniques conventionnelles de suppression et récupération des métaux. Le pouvoir de rétention de métaux lourds (Pb, Hg, Cd, Cu ,etc) sera abordé en un premier temps avec les polysaccharides actuellement caractérisés puis avec des molécules isolées à partir de nouveaux criblages. Les relations structure-propriétes de rétention seront analysées en fonction de la nature chimique de ces différents polymères.
3.4. Plasmides archaebactériens et transferts génétiques:
Les études génétiques sont de première importance pour comprendre les mécanismes de régulation cellulaire et pour le génie génétique des microorganismes ayant des potentialités biotechnologiques. La génétique des archaebactéries sulfothermophiles est pour l'instant très peu développée et pratiquement limitée au genre Sulfolobus. Cette situation est principalement due au fait que l'on ne dispose que de peu de marqueurs de sélection (rares mutant autotrophes ou résistants chez Sulfolobus) et d'éléments susceptibles d'être utilisés pour la construction de vecteur clonage. En effet, très peu d'éléments capables de réplication autonome sont connus et ils se résument à une forme lysogène de virus (SSVI) découverte chez Sulfolobus shibateii, et à un autre génome viral (DAV 1) décrit chez Desulfurolobus ambivalens.
La découverte d'un plasmide cryptique de 3,45 Kb chez une nouvelle espèce d'archaebactérie sulfothermophile isolée au LBM est à l'origine de ce projet, mené en commun par le LBM (L. Watrin, C. Jeanthon, D. Prieur) et le GRA (Y. Zivanovic, P. Forterre).
Le premier plasmide détecté (pGT5) a été purifié et une carte de restriction a été établie. Deux fragments Sau3A de pGT5 (1500 et 1900 pb) ont été intégrés dans le site BamHI du vecteur pAT153 (dérivé de pBR 322) et clonés dans la souche de E. Coli JM109. Le séquençage des clones recombinés est achevé et l'analyse de la séquence obtenue est en cours.
Des expériences préliminaires d'hybridation entre pGT5 et les autres plasmides détectés ont indiqué que certains de ces plasmides ne présentaient aucune homologie avec pGT5, tandis que d'autres présentaient quelques homologies. Ces points seront précisés et les cartes de restriction établies. Le crible pour détecter d'autres plasmides sera poursuivi.
L'analyse des ARN messagers présents dans la souche GE5 et codés par le plasmide pGT5 sera réalisée. Ces transcrits seront détectés par Northern Blot en utilisant comme sondes différents fragments de restriction de pGT5. Les sites d'initiation de la transcription seront localisés par cartographie à la nucléase S1. Ces expériences permettront d'identifier les promoteurs et le sens de transcription des différents ORF de pGT5 et d'avoir une idée de leur taux de transcription. Ces informations seront importantes pour la construction d'un vecteur de clonage. Elles permettront de déterminer quelles sont les régions codantes de pGT5, de localiser éventuellement l'origine de réplication du plasmide, de faire des hypothèses sur le sens préférentiel de clonage.
La recherche de marqueurs génétiques sera effectuée en premier sur la souche GE5 qui, outre l'intérêt de posséder un plasmide, est complètement caractérisée: en particulier son optimum de température pour la croissance est de 94*C, avec un temps de doublement de 33 minutes. De plus, il est facile d'en obtenir une biomasse importante (1,2g/litre) et elle cultive sur milieu solide en formant des colonies bien nettes, au point que le dénombrement des cellules viables sur boite de Pétri est possible, de même que des hybridations ADN/ADN sur filtre après empreinte.
A l'heure actuelle, les seuls mutants autotrophes ou de résistance à certains composés ont été isolés chez Sulfolobus. De plus, de nombreux antibiotiques sont inutilisables en raison de leur caractère thermolabile et/ou de l'ignorance de leur cible cellulaire chez les sulfothermophiles.
La novobiocine est très prometteuse car elle est active sur Sulfolobus à faible concentration et son action est spécifique de l'ADN topoisomérase II. Récemment des mutants résistants, notamment à la novobiocine ont été isolés chez Sulfolobus. De plus, il existe un gène de résistance à la novobiocine gyr Br) codant pour la sous-unité B de la gyrase isolée chez Streptomyces sphaeroides et un autre cloné à partir d'une souche appartenant au genre Haloferax.
La sensibilité de la souche GE5 à divers antibiotiques et métaux lourd sera donc recherchée et les besoins nutritionnels de la souche seront précisés, afin de mettre au point un milieu de culture minimum. L'étape suivante consistera à rechercher des mutants de résistance à tel(s) composé(s) ainsi que des mutants auxotrophes. Dans ce but, différents agents mutagènes pourront être utilisés et les mutants seront isolés sur milieu solide thermostable. La caractérisation d'un gène de résistance sera ensuite entreprise.
En l'absence de mécanismes naturels connus (conjugaison ou transduction) la seule possibilité de transfert génétique chez les sulfothermophiles est la transformation. L'électroporation est la technique sur laquelle repose le plus d'espoir. Elle a été appliquée avec une très bonne efficacité à de nombreuses souches dépourvues de systèmes naturels de transferts de gènes et elle a été employée avec succès dans le cas de Sulfolobus dans l'équipe de W. Zillig en Allemagne. Afin de procéder à ces essais, il sera nécessaire de curer GE5 de son plasmide. Le fait que des activités de restriction n'aient pas été détectés chez GE5 constitue un avantage supplémentaire pour le développement d'un système de transformation.
La construction d'un vecteur navette représente une étape ultime qui ne pourra être abordée que si les mutants recherchés sont obtenus. Dans ce cas on pourra procéder comme suit:
- utilisation de l'origine de réplication de pGT5,
- construction d'une "unité d'expression" en fusionnant un gène de résistance à un composé et des signaux forts de transcription (promoteur et terminateur) de GE5,
- utilisation d'une origine de réplication bactérienne et de marqueurs de sélection, permettant ainsi l'utilisation de ce vecteur dans E. Coli,
- utilisation de séquences de type Shine-Delgarno de GE5 une bonne expression du gène de résistance.
3.5. Biodégradation des hydrocarbures:
Un premier travail exploratoire a pour but de rechercher des peuplements bactériens capables de dégrader les hydrocarbures aromatiques à partir des échantillons prélevés durant la campagne "Guaynaut", effectuée en novembre 1991.
Après la campagne d'échantillonnage sur le site hydrothermal du Bassin de Guaymas, deux démarches complémentaires de travail ont été adoptées:
1- l'étude chimique des échantillons prélevés (fluides, sédiments, dépôts hydrothermaux) pour connaître les caractéristiques des hydrocarbures hydrothermaux et mettre en évidence les processus in situ d'altération microbienne,
2- la recherche des souches bactériennes capables de dégrader les hydrocarbures aromatiques par un travail de criblage en fonction de la nature des milieux de culture, des conditions aérobie ou anaérobie, de la température et de la nature du substrat carboné ( pétrole, hydrocarbures aromatiques légers ou polyaromatiques, hydrocarbures aromatiques soufrés de type dibenzothiophène). L'utilisation des hydrocarbures par des souches bactériennes sera également recherchée sur des isolats thermophiles caractérisés à partir d'échantillons de ce site hydrothermal.
A l'issue de cette phase exploratoire, qui ne devrait pas aller au-delà de juin 1993, un bilan sera effectué, d'une part en matière de recherche de peuplements bactériens hydrothermaux aptes à la dégradation des hydrocarbures pétroliers, d'autre en examinant la valeur des résultats obtenus en termes de potentialités de valorisation par rapport à ce que l'on connaît déjà. La poursuite de ce travail sera envisagée, à partir des résultats les plus significatifs, soit dans le cadre d'une valorisation potentielle des souches sélectionnées, soit dans la cadre de recherche à caractère plus fondamental sur des souches thermophiles (caractérisation des voies dégradatives, détermination des facteurs qui contrôlent la régulation de l'expression des voies de dégradation).
Révision le 10/12/96
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