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THEMES DE RECHERCHES ET RESULTATS MAJEURS
Dernière révision le 04/09/97
for English Version
Notre laboratoire
étudie les Archaea et les Bacteries hyperthermophiles
(HT) qui vivent à des températures proches de
100°C. Notre objectif est de comprendre comment ces
micro-organismes "fonctionnent" aux limites de la vie et de
déterminer leur origine : adaptation primaire ou
secondaire. Nous sommes particulièrement
intéressés par le monde à ADN dont la
mise en place a dû se produire à
l'époque de la divergence entre archaea,
bactéries et eucaryotes. Ces travaux nous
amènent à nous pencher sur toutes les grandes
questions concernant l'origine et l'évolution des
génomes.
Nous
étudions la topologie de l'ADN et les ADN
topoisomérases chez les archaea et les
bactéries hyperthermophiles (HT). Nous avons
montré que les plasmides des archaea HT sont
soit relâchés, soit surenroulés
positivement, c'est à dire qu'ils
présentent un excès d'enlacement par
rapport aux plasmides des mésophiles.
D'autre part, nous avons découvert chez les
archaea hyperthermophiles (HT) une famille
complétement nouvelle d'ADN
topoisomérases de type II, ce qui nous a
permis d'identifier in silico la
protéine qui pourrait être responsable
de l'initiation des "crossing over" chez les
eucaryotes. Nous nous intéressons aux
plasmides des HT comme : marqueurs de topologie,
matrice pour une éventuel système de
réplication in vitro et
vecteurs de clonage.
Cette
thématique est à la base de notre
participation a un projet européen (Biotech)
mené en collaboration avec les laboratoires
de D. Prieur à Roscoff et R. Garrett
à Copenhague: il s'agit de mettre au point
les conditions de cultures des archaea HT en
milieux liquide et solide, sur boite de Petri; de
mettre au point et de valider des méthodes
de transformation efficaces, ainsi que d'isoler des
mutants de résistance à des
inhibiteurs de croissance de façon à
pouvoir disposer de marqueurs
génétiques qui seront
intégrés dans un vecteur de clonage
et/ou d'expression pour les hyperthermophiles. Nous
avons mis en évidence plusieurs nouveaux
plasmides chez les archaea HT du groupe des
Thermococcales. Nous avons
séquençé l'un d'entre eux et
mis en évidence son mode de
réplication par cercle roulant.
Nous avons
identifié les familles de gènes
dupliqués (paralogues) chez E. coli. Ce
travail et d'autres études
phylogénétiques menées dans
notre équipe ont mis en évidence
l'importance des duplications de gènes avant
la séparation eucaryotes/procaryotes. Enfin,
nous avons montré que les résultats
publiés sur l'enracinement de l'arbre
universel dans la branche des bactéries
n'étaient pas fiables..
MOTS CLES : Hyperthermophiles, Archaea, ADN
Topoisomérases, Réplication,
Réparation, Recombinaison, Evolution,
Phylogénie Moléculaire.
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Le Monde de l'ADN à Très Haute Température
L'ADN en conditions HT in vitro (P. Forterre, E. Marguet).
Nous avons montré qu'un ADN fermé n'était pas dénaturé en conditions HT, au moins jusqu'à 107°C ; par contre, il est rapidement dégradé par dépurination et cassure de la liaison phosphodiester (15). Cette thermodégradation, qui est indépendante de la topologie de la molécule, est inhibée par des concentrations élevées de sel monovalent (15). La gyrase inverse des HT n'est donc pas nécessaire pour protéger l'ADN contre une dénaturation globale, ou contre sa dégradation.L'ADN in vivo chez les archaea HT et halophiles extrêmes (F. Charbonnier, F. Mojica, P. Lopez-Garcia, E. Marguet, D. Gadelle, coll. avec D. Prieur, W. Zillig et F. Rodriguez -Valera).
Nous avons isolé le premier plasmide d'une archaea HT, pGT5 de Pyrococcus abyssi (3) et montré qu'il était relaché à la température optimale de croissance (95°C) (4). Nous avons généraliser ce résultat à d'autre plasmides HT (13), en particulier grâce à l'isolement de nouveaux plasmides de Thermococcales et de Sulfolobales qui sont tous, soit relâchés, soit surenroulés positivement (25). Par contre les plasmides des archaea halophiles sont surenroulés négativement (13,16,17). L'ADN des archaea HT présente donc un "exces" d'enlacement (Linking number, Lk) par rapport aux ADN des mésophiles. Cet exces (probablement due à la gyrase inverse) pourrait maintenir l'ADN dans un état structural proche de celui qu'il possède chez les mésophiles. En accord avec cette hypothèse, nous avons montré que le Lk augmente au cours de chocs chauds et diminue au cours de chocs froids chez les HT. Le Lk augmente de même avec la température chez les archaea HT et halophiles (17) et chez les bactéries mésophiles. Les activités gyrase et gyrase inverse ont pu apparaitre au cours de l'évolution des procaryotes pour leur permettre de s'adapter à une gamme très large de température (0 - 110°C) (25).ADN topoisomérases HT (A. Bergerat, O. Guipaud, D. Gadelle, B. Labedan, coll. avec M. Duguet et F. Robb).
Nous collaborons avec l'équipe de M. Duguet depuis plusieurs années sur les Topo I, en particulier la gyrase inverse, chez les HT (7, 8). Cette équipe poursuivant l'étude approfondie de ces Topo I, nous avons concentré nos efforts sur les Topo II. Les bactéries HT qui possédent une gyrase inverse possèdent elles également une gyrase ? Nous avons cloné les gènes codant pour les deux sous-unités (s.u.) de la Topo II de la bactérie HT T. maritima . La s.u. correspondant à GyrB (gyrase) et/ou ParE (Topo IV) a été entièrement séquençé et nous avons construit un arbre de distance des 25 séquences GyrB/ParE connues. Contrairement à l'arbre des ARNr 16S, T. maritima ne branche pas en première position, mais se retrouve proche de B. subtilis , un résultat obtenu avec d'autres phylogénies protéiques. La faible résolution des branches ne permet pas de determiner si la Topo II de T. maritima est une gyrase ou une Topo IV. La purification de l'enzyme est en cours. Nous avons purifié à homogénéité et caractérisé les Topo II des archaea HT Sulfolobus shibatae (18) et P. furiosus . Ce sont des hétérotétramères composés de deux s.u. de 45 (A) et 60 kDa (B), et résistantes aux inhibiteurs classiques des Topo II. La s.u. B fixe l'ATP. Des séquences peptidiques obtenues à partir des des s.u. A et B de l'enzyme de S. shibatae ont permis de cloner et séquencer leurs gènes. Ceux-ci sont contigus et contiennent les séquences codant pour les peptides obtenus à partir des protéines purifiées.Etude du plasmide pGT5 (S. Marsin, N. Rollet, Y. Zivanovic, coll. avec D. Prieur).
Le plasmide pGT5 (3.4 kb) a été entièrement séquençé (27). Nous avons mis en évidence les signatures d'une réplication par cercle roulant : un gène codant pour une protéine apparentée aux endonucléase-ligases (Rep) des plasmides de la famille pC194 et deux origines de réplication (ori) potentielles double-chaîne (dso) et simple-chaîne (sso). La sso ressemble aux ori reconnues par le primosome bactérien. Nous avons mis en évidence chez P. abyssi la forme simple chaîne de pGT5 intermédiaire de réplication dans le mécanisme du cercle roulant (27).Premiers gènes d'archaea impliqués dans la réparation de l'ADN, la structure du chromosome et la division cellulaire [ A. Bouyoub, E. Gerard (coll. avec G. Barbier et J. Querellou), C. Elie].
Nous avons recherché des gènes d'ADN polymérases chez trois souches de Thermococcales (collection IFREMER). Le gène codant pour l'ADN polymérase de la souche GE8, qui contient une intéine, a été isolé. Dans la souche 700, nous avons identifié un homologue du gène dinF de E. coli , impliqué dans la réponse SOS (24). Chez les bactéries, dinF est précédé de recA ou de lexA. Le gène en amont de dinF chez la souche 700 a cloné et séquencé, il s'agit en fait d'un homologue du gène minD de E. coli , impliqué dans la division cellulaire. Au cours de ce travail, nous avons également isolé le gène purA de la souche 707, que nous utilisons actuellement comme marqueur génétique potentiel (voir ci dessous). Toujours en recherchant un gène d'ADN polymérase, nous avons découvert chez Sulfolobus acidocaldarius un homologue des ATPases eucaryotes de la famille SMC (Structural Maintenance of the Chromosome) et de RAD50 de levure. Ce sont des protéines moteurs de type "coiled-coil", en forme d'haltère, qui jouent un rôle dans la condensation des chromosomes ou dans la recombinaison.
Mise au Point d'Outils Génétiques chez les Archaea HyperThermphiles
Il s'agit d'un programme mené par Y. Zivanovic dans le cadre d'un projet européen, en coll. avec Prieur et Garrett. Nous avons montré que pGT5 contenant un insert entre ses deux gènes peut être transferé et se répliquer dans Pyrococcus (26). Toutefois, il est instable, ce qui pourrait provenir de son mode de réplication et/ou de l'absence d'un marqueur de sélection.
Découverte de nouveaux plasmides chez les Thermococcales, caractérisation de nouvelles souches (N. Rollet, P. Lopez-Garcia).
Une vingtaine de Thermococcales ont été étudiées, six plasmides différents ont été découvert. Leur tailles varient de 3,5 à 25 kb. Certain d'entre eux ont été détectés grâce à l'analyse des génomes totaux par PFGE. Au cours de ce travail, la taille du chromosome de plusieurs archaea HT a été déterminée (1.7 à 3.9 Mb).
Isolement du gène purA de Pyrococcus et de mutants potentiels purA . (Y. Zivanovic )
Les conditions de culture des HT anaérobies ont été mises au point (installation d'une pièce avec chambre anaérobie). Nous avons pu isoler à partir de colonies sur boite à 95°C des mutants de P. abyssi résistants à la 6-methyl-purine en présence d'hypoxanthine, potentiellement touchés au niveau du gène purA. Les gènes purA de la souche sauvage et du mutant ont été clonés et sont en cours de séquençage. Des constructions contenant le plasmide pGT5, le plasmide bactérien litmus et le gène purA résistant ont été réalisées.
Origine et Evolution des Génomes
Identification des familles de gènes dupliqués (paralogues) chez E. coli .(B.Labedan, coll. avec M. Riley).
L'analyse de l'ensemble des gènes de E. coli connus a permis d'identifier 52% de gènes paralogues (issus d'un même ancêtre par duplication) (22, 23, 54). Différents niveaux de paralogie ont été identifiés, permettant de définir les relations familiales entre groupes de gènes. 747 séquences connues de E. coli pourraient dériver de seulement 92 séquences ancestrales (23,54).
Mise en évidence de duplications de gènes antérieure à la séparation eucaryotes/procaryotes. (N. Benachenhou, P. Forterre, B. Labedan).
L'analyse phylogénétique des GDH [nous avons cloné le gène codant pour la GDH de S. shibatae (14)], des ADN pol (2, 11), des ADN topo I et II (11), des OTCases et des ATCases (coll. avec Glansdorff) a montré que les arbres obtenus n'étaient pas des arbres d'espèce. Leur topologie implique des duplications de gènes qui ont du se produire avant la séparation eucaryotes-procaryotes (9). Ce résultat nous a conduit à critiquer l'enracinement de l'arbre universel dans la branche des bactéries obtenus avec les ATPases (6, 10), cet arbre étant lui aussi entaché de paralogie. Un cas de transfert horizontal a été étudié en coll. avec J.Guespin (19). Ces analyses ont pu être couplées dans certain cas [GDH (14), purA] avec la recherche de signatures HT. En particulier, de nombreuses délétions dans la protéine purA de Pyrococcus pourraient aboutir à une structure plus compacte de la protéine.
Origine des HT, application de la méthode cladistique au problème de l'enracinement de l'arbre universel. (P. Forterre, C. Elie).
L'étude moléculaire des HT, en particulier l'analyse du gène de la gyrase inverse, nous a conduit à remettre en cause l'existence d'un lien entre origine de la vie à haute température et apparition des HT (20, 28). Nous avons proposé une nouvelle hypothèse pour expliquer pourquoi l'ancêtre commun des archaea et des bactéries était un HT (21, iv) : l'apparition du "phénotype procaryote" par thermoréduction. Dans cette hypothèse l'arbre universel est enraciné dans la branche des eucaryotes. Or, une racine bactérienne a été proposée d'après l'analyse phylogénétique des facteurs d'élongation et des Ileu tRNA synthétases. Toutefois, en applicant une analyse cladistique stricte aux alignements de séquence de ces protéines, nous avons montré que cette racine bactérienne n'était pas robuste (6). Pour déterminer si les archaea et les bactéries étaient spécifiquement apparentée, nous avons essayé de déterminer si elles possédaient un même type d'oriC. 6 kb du chromosome de Haloferax volcanii , en amont du gène gyrB de cette archaea ont été séquencés (région conservée chez les bactéries et qui contient très souvent dnaA et oriC). Nous avons identifié une ORF qui présente de faible similarité avec dnaN, un gène proche de OriC chez de nombreuses bactéries, mais nous n'avons pas mis en évidence d'homologue de dnaA.